原理

蛋白質(zhì)表面一般有疏水與親水基團(tuán)，疏水層析是利用蛋白質(zhì)表面某一部分具有疏水性，與帶有疏水性的載體在高鹽濃度時結(jié)合。在洗脫時，將鹽濃度逐漸降低，因其疏水性不同而逐個地先后被洗脫而純化，可用于分離其它方法不易純化的蛋白質(zhì)。

疏水性蛋白質(zhì)溶解于水溶液中時會發(fā)生自我聚集或自身相互作用。這種自我聚集是形成多種生物學(xué)相互作用的基礎(chǔ)，如蛋白質(zhì)的折疊、蛋白質(zhì)-底物間的相互作用及蛋白質(zhì)，通過細(xì)胞膜的跨膜運輸。疏水作用層析可用于分析和制備規(guī)模的蛋白質(zhì)純化。

HIC 主要利用大分子中存在的疏水性區(qū)域與層析吸附劑上的疏水性配體結(jié)合。這種相互作用發(fā)生于有利于疏水相互作用的環(huán)境，如高鹽濃度溶液。對于非極性分子，水(極性溶液)本身不是一種好的溶劑。

在這種環(huán)境下，蛋白質(zhì)會發(fā)生自我聚集或者形成聚集體，使其自身處于zui低的熱力學(xué)能狀態(tài)。在蛋白質(zhì)發(fā)生自我聚集以前,水分子會在其每個分子周圍形成高度有序結(jié)構(gòu)。

在極性溶液中，非極性分子(如蛋白質(zhì))的自我聚集受到環(huán)境中凈熵值增加的驅(qū)動。在蛋白質(zhì)聚售過程中，暴露于極性溶劑的蛋白質(zhì)疏水位點整體表面區(qū)域減少，從而形成縮小結(jié)構(gòu)(高熵的)環(huán)境，這是一種更有利的熱力學(xué)狀態(tài)。

用途

疏水層析不具備高分辨率，但其特性與離子交換層析互補，可用于純化難以分離的蛋白質(zhì)。

實例1:

雞蛋溶菌酶和鯨肌球蛋白的同步分離純化
采用 Pheny1 SepharoseHP 色譜柱，實現(xiàn)對雞蛋溶菌酶和鯨肌球蛋白混合。

200 操作過程:

①用 5 倍柱體積的緩沖液 A(50mmol/L磷酸鈉， pH 為 7.0;2molL)衡柱子，保證穩(wěn)定。

②進(jìn)樣 1.5mL 品，用4倍柱體積緩沖液 A 沖洗柱子，用 0~100% 的緩沖液 B 進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積大于 30 倍柱體積，收集取樣1mL。

③用 4 倍柱體積的緩沖液 B(pH7.0，50mmoVL 緩沖)進(jìn)行洗脫。流速控制: 2mL/min，測定在 280nm 吸光度值。

材料與儀器

試劑：
10% 硫酸銨溶液、平衡緩沖液為 10 mmol/LNa2HPO4，/NaH2PO4，1.0 mol/L（NH2SO4（pH7.4）；洗脫緩沖液為 10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4（pH7.4）、SDS-PAGE

材料：層析柱、色譜填料

儀器： pH計、勻質(zhì)機、離心機、蛋白純化儀

步驟

1．硫酸銨鹽析取組織勻漿 30 g 溶于 60 ml 硫酸銨溶液（10%）中，攪拌溶解 4 小時，12000 g 離心 20 分鐘；取上清液，緩緩加入硫酸銨粉末并不斷攪動，使溶液達(dá)到 35% 的飽和度，常溫靜置 2 小時；12000 g 離心 20 分鐘；

取上清液，繼續(xù)緩緩加入硫酸銨粉末并不斷攪動，使溶液達(dá)到 70% 的飽和度，常溫靜置 2 小時。12000 g 離心 20 分鐘，棄上清液，將沉淀溶解后進(jìn)行疏水層析。

2．疏水層析應(yīng)先用小號柱子進(jìn)行層析條件的摸索，包括層析介質(zhì)、結(jié)合和洗脫條件等。先選用 2.6 cm x 10 cm 層析柱，平衡緩沖液為 10 mmol/L Na2HPO4，/NaH2PO4，1.0 mol/L（NH2SO4（pH7.4）；洗脫緩沖液為 10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4（pH 7.4）。

選用 Phenyl Sepharose FF、Octyl Sepharose FF 和 Butyl Sepharose FF 三種疏水介質(zhì)進(jìn)行比較，梯度洗脫，流速為 0.2 ml/min。預(yù)實驗完成，選擇純化效果相對更好的 Butyl Sepharose FF 介質(zhì)、7.6 cm x 10 cm 層析柱，進(jìn)行大量層析純化。

3．純度鑒定用 SDS-PAGE 鑒定純化蛋白的純度。同時應(yīng)定量測定純化產(chǎn)物的胰激肽釋放酶活性。

4．實驗結(jié)果分析 35% 飽和度的硫酸銨溶液沉淀可以除去粗品中的部分雜蛋白；再通過 70% 飽和度的硫酸銨溶液沉淀后，不但可以將胰激肽釋放酶蛋白全部沉淀，同時可起到濃縮樣品的作用。實驗采用高離子強度緩沖液平衡，胰激肽釋放酶吸附于疏水介質(zhì)上，然后在低離子強度條件下洗脫。

實驗中發(fā)現(xiàn) Octyl Sepharose FF 吸附蛋白能力最弱，在洗脫初始階段，大部分蛋白即被洗脫下來；PhenylSepharose FF 吸附蛋白能力zui強，洗脫液離子強度很低的條件下大部分蛋白才被洗脫下來，這兩種介質(zhì)對分離胰激肽釋放酶蛋白的效果都不明顯。

Butyl Sepharose FF 介質(zhì)疏水性適中，可以保證溫和條件下洗脫胰激肽釋放酶。SDS-PAGE 分析結(jié)果表明鹽析后經(jīng)過一步疏水層析提純，得到比活性大于 500U/mg 的胰激肽釋放酶蛋白，電泳膠銀染色顯示有分子量在 28 kDa 左右的條帶，符合預(yù)期。

注意事項

1、在樣品上樣于層析柱之前，必須采用高濃度鹽的緩沖液提高蛋白質(zhì)混合物(將要采用 HIC 吸附劑純化的樣品)的鹽濃度，目的在于使目標(biāo)蛋白質(zhì)能夠與吸附劑結(jié)合。

2、蛋白質(zhì)在高鹽濃度下可能發(fā)生沉淀，所以，在選擇鹽溶液之前，應(yīng)先評估蛋白質(zhì)復(fù)合物在給定鹽溶液中的溶解性。

3、緩沖液的 pH 對于蛋白質(zhì)結(jié)合于 HIC 吸附劑的影響并不呈一般性的趨勢，但是可以影響相互作用的強度。選擇緩沖液的 pH，應(yīng)該確保蛋白質(zhì)和吸附劑在該環(huán)境下能夠穩(wěn)定(如避免使用過高/過低的pH 溶液)。

4、在調(diào)整蛋白質(zhì)上樣的步驟中，鹽的濃度可以為 05~20mol/L，并且可提高濃度以確保蛋白質(zhì)能夠有效結(jié)合于吸附劑。

5、蛋白質(zhì)結(jié)合于吸附劑所需要的鹽濃度在很大程度上取決于鹽種類的選擇。如部分所述鹽種類。在大多數(shù)情況下，選擇蛋白質(zhì)結(jié)合于吸附劑的適合鹽濃度需進(jìn)行相關(guān)的預(yù)實驗。蛋白質(zhì)結(jié)合于吸附劑上之后，必須再將目標(biāo)蛋白質(zhì)洗脫，并收集層析柱柱后的流出液。多數(shù)情況下，洗脫過程用于將不需要的蛋白質(zhì)從目標(biāo)蛋白質(zhì)中分離或者去除。不需要的蛋白質(zhì)可能與吸附劑結(jié)合的不是那么緊密,因而會先干目標(biāo)蛋白質(zhì)被洗脫。

另外一些情況下，不需要的蛋白質(zhì)會與吸附劑結(jié)合更加緊密，并會在目標(biāo)蛋白質(zhì)被洗脫之后仍與吸附劑結(jié)合。這種情況通常發(fā)生在 HIC 分離蛋白質(zhì)多聚體時，目標(biāo)蛋白質(zhì)多聚體與吸附劑的結(jié)合比單體與吸附劑的結(jié)合更加緊密。在洗脫步驟中，流出液組分可能含有高純度產(chǎn)品,但在其之前或之后也會含有大量的不需要的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。

常見問題

1、蛋白質(zhì)在高鹽濃度下可能發(fā)生沉淀，所以，在選擇鹽溶液之前，應(yīng)先評估蛋白質(zhì)復(fù)合物在給定鹽溶液中的溶解性。

2、緩沖液的 pH 對于蛋白質(zhì)結(jié)合于 HIC 吸附劑的影響并不呈一般性的趨勢，但是可以影響相互作用的強度。選擇緩沖液的 pH，應(yīng)該確保蛋白質(zhì)和吸附劑在該環(huán)境下能夠穩(wěn)定(如避免使用pH過高/過低的溶液)。

3、可加少量還原劑或者去污劑防止蛋白聚集。

4、蛋白低鹽洗脫后盡快換至穩(wěn)定緩沖液中。

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