你知道流式細胞周期檢測的常見問題有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、樣本制備注意事項

1.根據(jù)不同的檢測細胞調(diào)整合適的溫度、濕度、酸堿度等培養(yǎng)環(huán)境，注意一定要無菌的環(huán)境培養(yǎng)。

2.培養(yǎng)細胞時，以對數(shù)期處理為宜，避免細胞量過少導致收集細胞量不足或者細胞量過多導致細胞開始大量死亡造成的實驗誤差。

3.流式檢測細胞周期上機檢測所需收集細胞量較多，收集細胞時盡量多收集一些

4.流式檢測對細胞離心，重懸次數(shù)較多，注意動作輕緩，避免過多地損傷、弄破細胞。

5.本實驗對細胞離心，重懸次數(shù)較多，注意動作輕緩，避免過多地損傷細胞。

6.細胞周期待測細胞盡量要獲得單個細胞，避免DNA的降解。

7.樣本最關鍵的就是減少碎片(EDTA/不可過度吹打/離心rpm)。PI既能與DNA結(jié)合，又能與RNA結(jié)合，所以要用RNase降解。PI質(zhì)量及RNase所加量很重要，建議用商品化試劑。

8.污染脫氧核糖核酸酶會降解DNA，故玻璃器皿和試劑要干凈滅菌。

9.染液等物質(zhì)有一定毒性，注意防護。

二、流式檢測時的注意事項

1.固定時必須預冷PBS重懸打入無水乙醇中，做到隨加隨混勻，避免細胞形成團塊。

2.固定后細胞雖然可以保存較長時間后再上機檢測，為避免不可控因素影響最好盡早上機檢測。

3.進樣速度：一般檢測細胞濃度調(diào)整為2*10^5到2*10^6/ml，建議進樣速度為低速。若峰形較寬、CV較大，可能就是進樣速度太快。

4.儀器質(zhì)控定期做，檢查質(zhì)控微球的CV值，盡可能排除因機器設置引起的峰形加寬。

5.通過電壓脈沖信號的寬度、高度、面積等參數(shù)區(qū)別實體組織標本中的粘連細胞群體，zui大程度的減少粘連細胞帶來的假陽性結(jié)果。

6.選擇合適的細胞系，不同的細胞系由于細胞形態(tài)、直徑等不同，會對結(jié)果的美觀程度有一定的影響，筆者常用HeLa細胞系，峰形較細，周期各階段明顯區(qū)別，結(jié)果美觀。

7.建議選擇6孔板操作，細胞給藥密度在40%左右，給藥時間不一定要與蛋白印跡法給藥時間一致。這是由于蛋白印跡法檢測的是蛋白表達的變化，例如給藥10小時，蛋白上可見明顯變化趨勢，但10小時收樣時，孔內(nèi)細胞已經(jīng)明顯觀察到細胞漂浮凋亡，那對流式檢測的結(jié)果會有很大的影響。流式細胞術收樣時，盡量保證孔內(nèi)細胞還未漂浮。

8.收樣時，如果孔內(nèi)已經(jīng)有細胞漂浮，細胞上清懸浮液也要收集。建議選用胰酶消化，消化時間必須嚴格控制，及時終止消化，消化時間太久，容易對細胞造成損傷和死亡。

9.收集細胞時，離心機選用4℃，300-500g離心5分鐘，小心吸去上清。加入0.3 mL預冷的PBS，將管內(nèi)的細胞混勻后，再加入0.7 mL預冷的無水乙醇，4℃固定過夜。整個收樣過程中，不要用槍頭劇烈吹打細胞，一是會損傷細胞，二是造成細胞損失。

10.上機前，離心機選用4℃，300-500g離心5分鐘，棄去上清。此時格外需要注意的是由于不同時期細胞的重量不一樣，離心后細胞不是全部沉淀在管底，管壁上也會存在大量細胞，去上清一定要注意。加入100 μg/mL的PI染色液，避光染色15分鐘以上，上機測試前最好使用200目篩網(wǎng)過篩，以免細胞聚集堵塞機器管道。

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